以下文章最初发表于2019年11月11日的《细胞培养皿》杂志这里．
类器官的培养使研究人员能够使用一个高度生理相关的系统来研究人类疾病。人体类器官反映了肾、肺、肠、脑和视网膜等器官的关键结构和功能特性，使它们具有极高的价值，特别是在对体外人体模型需求未得到满足的情况下。
虽然它们的价值是不可否认的，但培养有机体可能是非常具有挑战性的。对于有机型培养，已经开发了许多工具和技术，但根据细胞类型，研究区域和实验目标，可能难以识别正确的方法。
在这次专家问答环节中，我们已经召集了一个专家团队来回答您关于使用类器官进行疾病建模的问题。请参阅下面专家的简历。
杰王，博士。
康宁生命科学公司发展助理
王杰，康宁生命科学发展副研究员。在她在马萨诸塞州贝德福德的康宁发现实验室工作的10年期间，她领导了多种重组蛋白和细胞基础产品的开发。她在波士顿学院获得博士学位，在哈佛医学院获得博士后培训。
伊丽莎白亚伯拉罕，博士。
康宁生命科学高级产品经理
2008年以来，伊丽莎白已在康宁生命科学（CLS）中受雇，并在各种职能中担任多个职能，包括研发，项目管理和业务。在CLS，她领导了各种新产品的发展，包括高级细胞外基质/表面涂层和实验室装置，用于哺乳动物初级和干细胞的培养。她曾撰写了23篇期刊文章，技术说明，是11项专利的发明者。在她早期的职业生涯中，她在细胞疗法中进行了评估潜在的干细胞治疗糖尿病。目前，她是有机体和3D细胞培养产品的商业领先;将客户的声音翻译成新概念并在全球范围内将其商业化。
Franziska Wienholz，博士
科学支持专家EMEA
Franziska Wienholz对DNA损伤修复进行了博士学位研究，她能够进入其分子调节的见解，有助于了解细胞如何处理DNA损伤以防止过早老化和癌症。自2017年以来，她曾在康宁的科学支持专家工作，在那里她参与了在设计和建立实验中的产品支持，以及通过在诸如研讨会等客户面临的客户方面提供科学数据的建议和外部客户网络研讨会。
Sylvia F Boj，Ph.D.
Hubrecht Organoid Technology科学总监
Sylvia F Boj于2006年在西班牙巴塞罗那大学获得博士学位，她在IDIBAPS的工作是破译胰腺细胞中MODY基因转录作用的功能遗传分析。
随后她随后加入了Hubrecht Institute（荷兰Utrecht，荷兰）作为博士后的研究员。在Hans Clevers教授的实验室中，她首先研究了这个角色TCF7L2调节新陈代谢。然后，她建立了一个在体外人类胰腺癌的类器官模型。2014年，她加入Hubrecht Organoid Technology(乌得勒支，荷兰)，担任囊性纤维化和癌症项目的小组负责人。2016年,她被任命为科学中心主任,把科学进步的终极目标的瀑样技术新药的发展,通过与制药公司交流,和发展临床试验验证的预测价值瀑样反应的患者。
我们想对我们的类器官进行长期测试，但我们无法让它们超过24小时。你对推广我们的文化有什么建议吗?
生成类器官是一个微妙的过程，需要对所使用的特定细胞和应用进行调整和测试。类器官培养也是一个同样敏感的过程，需要对细胞和类器官的具体要求进行评估。
有机物的成功生成和长期培养取决于许多因素，包括:
- 细胞类型（干细胞？来自哪个器官？）
- 培养条件(培养条件，培养基，使用的ecm ?)
- 细胞挑战(低生存能力，可分解的器官，等等)
- 在生成有机体后计划是什么试验？
由于在这个问题中没有列出这些信息，我们想分享一些关于有机物的生成和培养超过24小时的有用技术文件:
申请笔记：
你知道有什么地方有基于细胞类型创造不同类型器官的协议吗?
近年来,康宁®Matrigel.®矩阵在基础研究和药物发现等领域，已经发展成为一个强有力的类器官培养的新工具，有几个可用的协议来支持这项工作。请在下面找到一些技术文件建议，支持创建不同类型的有机物。
康宁基质基质和类器官培养的引文
研究文章引用的汇编，其中几个类器官被引用。
用类器官建模发育和疾病
在这篇综述文章中，Hans Clevers概述了几种器官类型以及它们是如何生成的。使用这些基本信息作为起点，我们建议对特定的器官类型进行特定的文献搜索，以找到最适合所需应用程序的协议。
器官模型和应用
参观康宁生命科学有机体模型和应用网页，了解有关各种有机体类型的更多信息，并访问相关的公布的地标论文，讨论产生有机体的方法。
更具体的器官资源:
胃肠道瀑样
单个Lgr5干细胞在体外构建隐窝绒毛结构而没有间质生态位
前列腺有机体
人前列腺类器官培养中多能管腔祖细胞的鉴定
将人的胚胎干细胞分化朝向肾谱系产生自组织肾脏
卵巢瀑样
长期的类器官培养显示，在小鼠输卵管的伞状部分有丰富的类器官形成的上皮细胞
肝脏和胰腺类器官
自我更新的人和小鼠肝脏和胰腺三维器官的培养、建立及其遗传操作
我们正在寻找一种合成替代康宁基质培养我们的肠道细胞类器官。你能推荐一个吗?
近年来，人们对评价基质基质替代培养类器官的方法越来越感兴趣。研究人员已经证明，海藻酸盐和功能化聚乙二醇(PEG)配方可以支持人类多能干细胞衍生的肠道类器官以及健康小鼠肠道组织的器官祖细胞。然而，研究人员需要适当调整合成水凝胶的刚度和功能化。控制生物化学线索和结构支持对获得成功的器官生长是很重要的。这里有一些关于这些方法的链接。
在这种情况下，同样重要的是要注意，许多这些合成选项中的许多可能与基质素基质中的许多能够以其支持有机体培养物的能力。例如，合成制剂可以支持来自健康肠组织但不是患者衍生的有机体的有机体生长;它们可能不支持与细胞体生长相关的各种形态（芽囊囊性形式）。在多能干细胞（PSC）的那些情况下，在移动到合成环境之前仍然在基质胶质基质中延长PSC;因此，尚未识别Matrigel基质的总合成替代品。
康宁最近推出了新的有机物培养基质，一种优化的ECM，提供生化线索，孔隙度和硬度培养肠道类器官。
我很好奇可扩展性。为此工作用于药物发现，吞吐量必须相当高。我很想听到你对如何提高吞吐量的看法。
有机体的性质为药物发现提供了绝佳的基础。如问题所引用的那样，需要大量的有机体来将有机玻璃移动到高通量筛选环境中。虽然该领域仍存在挑战，但包括劳动密集型工作和时间，但有协议简要介绍如何扩展有机玻璃。
应用笔记和审查文章：
为了可伸缩性，可以在单孔板中镀有器材。当为药筛制备有机体时，额外的分裂，其中有机体处理1：1并再次镀1-2天，可以显着提出有机体的数量。这使得有机体的时间从破坏的压力中恢复，并让它们达到筛选活动的适当尺寸（20-70μm）。我们没有良好的体验有机体用于药物筛选作为单细胞，因为并非所有单一细胞都能够生长为有机体。在操纵用于药物筛选的有机体期间，我们建议用Rhoki10μm补充洗涤培养基，以减少产生的有机体，这些压力不会被ECM包围。我们不建议在收集所有材料的同时在冰上存放有机体。
Higher throughput for drug screening can be achieved by studying organoid in HTS microplates (e.g. 384-well plates) coated with Corning Matrigel matrix, using the “sandwich” method or embedded method (refer to Corning CLS Guideline for use SPC-356255-G). You can also refer to the article, “三维结肠癌患者源性器官培养高通量筛选平台的建立和验证，报告了384孔格式的结肠癌患者3D类器官培养高通量筛选平台的建立和验证。
我们还没有看到3天后用肝细胞细胞的有器材形成，如果我们提供更多时间或重新开始？
通常，3天是非常短的时间，但它也取决于原始材料（小鼠或人肝细胞）的性质，以及在分离后肝细胞是否被覆盖为单细胞或细胞团块。在单一人肝细胞细胞的情况下，它将需要超过一周才能开始观察肝细胞体。
在传统的2D单层培养条件下，原代人肝细胞(PHHs)迅速丧失肝脏表型，而3D培养的PHHs可维持数周的活力和功能。
为了支持3D肝球体模型在药物发现和开发研究，康宁提供三维球形合格的原代人肝细胞使用康宁球体微型板块．使用应用说明中描述的协议:3D原代人肝细胞(PHH)球体与2D PHH单层培养相比，显示对药物诱导的肝损伤的敏感性增加， PHHs形成小细胞团簇，大细胞聚集，然后在6 - 7天内形成球形。PHH球体一旦形成，形态和尺寸测量表明，球体在4周内保持稳定。
根据这一发现，球体的生成可能需要7天。
但是，那些球形从原发性人肝细胞产生。有机体可以由例如隔离的管道细胞产生。在“文化和建立自我更新人和小鼠成人肝脏和胰腺3D细胞体及其遗传操作”中，描述了用于产生有机体的方案，其中培养了分离的管道细胞康宁人工基底膜基质在培养约7天后，可以看到类器官。
对于这两种方法，球体/器官的形成可能需要7天。因此，我们建议继续培养细胞，并在第7天重新评估类器官的存在。
我们正在使用来自Hans Clever纸的媒体来生长肝细胞的有机体。您多久推荐一次媒体更改？我们看到一些有机体在媒体发生变化后的某些有机体在每2-3天变化后死亡。
为了支持器官生长，我们建议每2-3天更新一次培养基。有些化合物在37°C的温度下几天后就不太稳定了。观察到，在介质恢复后，类器官立即死亡，这表明需要对介质配方进行修订或优化。你也可能需要优化试剂的最终浓度，因为如果这些配方都是正确的，类器官的死亡是不可预料的。
您是否有转向癌细胞球体进入有机体的方案？
尽管从癌细胞中生成类器官似乎是矛盾的，但研究人员现在正专注于这种方法来研究癌症中发现的异质性以及个体化医疗的发展。癌类器官可以概括器官功能并表达器官特异性标志物，如下文所示:病人来源的肺癌器官作为治疗筛选的体外癌症模型。
有几篇文章是可用的，其中描述了从癌症患者的活组织检查产生的器官。例如:癌症样本在下一级生物库：将组织与生活单元储存库相结合以促进精密药物。
可能由于球体的性质，关于从球体产生类器官的资料比较有限。然而，在下面的文章中已经描述了“肠道”球体可以形成类器官，提高有机物成品率的工艺工程方法。
我正在做一个多步骤的长期实验，我需要冷冻保存我的器官，然后在一个月后解冻它们。我在努力寻找做这件事的最佳方法。
类器官的低温保存对于改进基于类器官的治疗和获取大量细胞变得越来越重要。请在这里找到一篇文章，其中描述了非解离或解离的肠道类器官的低温保存:长期培养诱导的表型差异和rhO激酶抑制剂治疗时间对小肠有机体的高效冷冻保存。
有趣的是，当使用老鼠或人类的类器官时，冻结的协议可能不同。这是礼仪手册描述了有机体培养，包括用于人和小鼠有机体的冷冻保存的细胞体培养物。
此外，我们已经观察到，在器官解冻后，细胞存活率显著增加，经过处理后，如在Tuveson实验室协议，步骤1至小尺寸（30-40μm之间），有机体在55％细胞外基质（ECM）下降1-2天。通过这种电镀步骤，我们让有机体从破坏的应力中恢复，但在冻结之前也会激活增殖状态。1-3天后（取决于人体有机体模型，例如1天后，有些有机体在视觉上增加（结肠），而其他有机体在视觉上增加，而其他有机体需要三天（肺或乳房）。我们从ECM下降并冻结它们遵循步骤3的步骤。我们观察到，在颗粒中存在一些ECM在有机体的存活中不会产生负面影响，因此不需要删除ECM的额外洗涤。我们建议自由吸引ECM来自颗粒的有机体。
我对筹码的培养并不熟悉。这项工作如何与普通文化进行比较？
当使用更复杂的器官模型时，有许多重要的因素需要考虑，包括细胞外基质、流体运输、受控介质交换和空间分离。对于这些更先进的模型，结合使用细胞外基质和“芯片上的器官”方法可能是有用的。这种芯片就像一个“支架”，可以用来制造隔间。
请在这里找到一些在芯片上培养的器官:
- 肠道芯片微环境诱导人肠道细胞进行绒毛分化
肠道器：使用芯片允许培养物具有顶端和基石侧，允许细胞显示肠细胞的增加标记。 - 在三维培养模型中，间质流动调节内皮细胞的血管生成反应和表型
血管形成:迄今为止，血管的形成仅在3D细胞培养中被成功证实。结合芯片，可以模拟间隙流体流动、剪切应力和生长因子梯度。
与2D培养相比，培养器官的成本如何?时间和实验室资源呢?
这个问题特别难以回答，因为没有格式、体积和协议具有可比性的“标准”2D或3D细胞培养协议。一般来说，用于2D细胞培养的产品不如用于3D细胞培养的产品先进，因此，3D细胞培养的直接成本通常高于传统单层细胞培养的实验成本。此外，在几天内，一个简单的单层细胞可以形成;3D细胞结构如类器官的生成可能需要几天时间，但在此期间，细胞培养人员不需要进行详细的步骤。
然而，在某些应用中，传统的2D实验无法得出与3D细胞培养实验相同的丰富答案，因为在3D环境下生长的细胞更接近于组织和器官的体内行为。3D细胞培养环境为药物发现创造了更多的生物学相关模型，这可能导致更多的预测结果，更高的药物化合物测试成功率，更快的市场路径，并降低开发成本。如果您对在您的实验室中建立3D细胞培养和生成有机物感兴趣，可以使用产品和解决方案，使开始3D细胞培养变得容易，例如。康宁球体盘子或者有机物培养用康宁基质．
关于3D细胞培养的其他资源:
瀑样模型
球体模型
组织模型
有机体培养依赖于基质/支架，通常康宁基质素基质，其本身可以提供许多有助于有机体生长/分化的生长因子等。是否有替代，较少的生物活性基质，可以支持有机培养物？
在Hubrecht Organoid Technology，康宁人工基底膜基质是迄今为止支持类器官模型扩展的最好的细胞外基质(ECM)。为了减少生长因子或其他蛋白质/分子的存在所产生的可变性，我们总是与之合作经济增长的因素都可以降低和无酚红矩阵的版本。我们一直在寻找生物细胞外基质的合成替代品，但迄今为止，我们测试过的任何东西都无法支持类有机物的生长，达到基质基质的可比水平。
为了支持有机物研究的可重复性和一致性，康宁最近推出了用于有机物培养的Matrigel matrix。经过验证，这种优化的配方支持有机物的生长和分化1，每个批次都测量了基质刚度，这是支持有机物工作流程的特性。有机物培养基质已经被证明可以成功地从健康和疾病的细胞来源生长器官2．每个批次都有资格形成常用于有机培养物中的稳定的“3D圆顶”结构。
你能解释一下什么时候你想用无血清的培养基进行类器官培养，或者什么时候可以用含血清的培养基。
在确定条件下扩展有机体时，我们建议避免使用血清。在汉斯夹心实验室开发的所有培养基中，当组织特异性有机体模型需要存在Wnt3a（即人肠道模型）时发现血清的存在。WNT3A条件培养基含有5％胎牛系统（FBS），并且是生产活性WNT3A的最强大的方法。幸运的是，无血清Wnt3a的替代来源正在成为可用的，例如代理wnt（Garcia Lab，Stanford），使得可以在没有血清的情况下扩大有机体。
扩散动力学和有机体健康和大小 - 改善这一点的文化策略是什么，以允许较大的有机体培养？在相同的静脉 - 支持有机体长期培养的策略，模仿血管化？
扩散动力学可以调节有机体尺寸和健康：在达到一定的尺寸后，有机体捕获生长并发展恶性核心。该方法可能与来自增殖的干燥状态的切换有关，与不增殖的DI FF渗透状态，以及有机芯的坏死。终端DI FF闭形可以是限制有机体大小但预防坏死核心对于有机体健康至关重要的策略，因为它可能导致过早分化。有机体周围的营养素流动是科学文献中讨论的技术，以协助预防坏死核心。有机体血管化是长期文化的重要标准;播种系统内的内皮细胞以允许形成血管（新血管生成）以及使用BioPlinting来工程师，细胞的架构和放置是对该目标探索的重要平台。
