冻结瀑样
适当的冷冻可能意味着那些能存活很长时间的细胞和那些马上死亡的细胞之间的差异。根据自然的协议，一个好的方法论遵循以下10个基本步骤。
- 将冷冻容器冷却至4°C。根据你使用的是6孔板还是48孔板，为每个冷冻瓶准备至少一到两个融合孔。
- 使用1000µL移液管和500µL至1000µL的基础培养基上下移液，以分解含有类器官的基础基质。
- 将带有类器官的悬浮液移至15ml离心管。
- 在类器官中加入冷的基础培养基，反复重悬以去除基础基质。
- 设置离心机在100 × g和200 × g之间，在8°C。跑5分钟。
- 抽除约2ml的上清液。避免将类器官分解成单个细胞。
- 在类器官中加入更多的冷基础培养基。
- 设置离心机在200 × g到250 × g之间，8°C。跑5分钟。
- 根据您使用的是6孔板还是48孔板，每孔或两孔抽吸所有上清液并在500µL冷冷冻培养基中重悬。
- 将悬浮液转移到500µL的冷冻瓶中，并置于冷却容器中。立即将容器转移到-80°C;保存至少24小时，然后将类器官转移到液氮中进行长期冷冻。
请注意:冷冻介质中含有DMSO等冷冻保护剂(CPA)，在室温下对细胞有毒。为了冷冻时的细胞活力，细胞在收获过程中需要避免在室温下过度暴露于CPA。
你冷冻的不是单个细胞，而是类器官，它们每天都在变得更大、更复杂。
康宁生命科学公司(Corning Life Sciences)的高级应用科学家希拉里·谢尔曼(Hilary Sherman)说:“类器官在冷冻时的大小会对它们最终解冻时的恢复产生重大影响。”“通常，较小的类器官在冻融过程中存活得更好。”
谢尔曼说，如果保存得当，文化可以持续很长一段时间——甚至长达十年——这使得实验在新信息出现时具有长期效用。
谢尔曼说:“研究人员想要长时间储存他们的类器官有很多原因。”“如果你正在建立一个库，你可能有一个潜在的治疗方法，你想用多年前的病人样本进行测试。也可能是你接手了别人在获得博士后之前就开始的工作，然后继续前进。”
培养瀑样
制造类器官的方法不止一种——你可以在液滴圆顶中形成它们，使用生物反应器将它们扩大到高通量使用，或者使用渗透性支撑和低粘附的微孔板。你选择的方法取决于你想从实验中学到什么。
- 矩阵穹顶将单个细胞或组织置于独立容器中细胞外基质这样类器官就可以组装了。如果研究人员没有大量的类器官材料，或者如果他们担心按表面积扫描图像需要太长时间，他们可能会选择这种方法。
- 生物反应器将多能干细胞制成的类器官包裹在细胞外基质中。它们是高通量用途的理想选择，在这种情况下，您需要扩大大量类器官或长时间培养。
- 渗透性支架和低粘附微孔板机械地支持类器官气液界面材料或超低附着力，防止细胞结合。它们是希望进一步分化细胞或进行终点分析的研究人员的理想选择。预镀板可以节省更多的时间。
根据你的过程，你可以在短短六天内培养出一个类器官。但谢尔曼建议在收获过程中尽可能保持大小相似。
“当你分解类器官时，你是把它们分解成不同大小的碎片，”她说。“你越能保持它们在尺寸上的一致性，你就越能确保它们在未来的应用中以同样的速度增长。帮助减少这种可变性的一种方法是让重力把较重的类器官固定在管道的底部，这样较小的类器官就会留在顶部。这样，你就可以收集你想要的种群，进行更均匀的收获。”
测量瀑样
在测量类器官时，有很多利害关系。你需要把它做好。
康宁生命科学公司的科学支持专家Kyung-A (Katie) Song博士说:“大小是确定类器官建立的几个因素之一，所以它非常重要。”“此外，类器官只能生长到有限的大小在体外由于缺乏循环系统，氧气和营养的转移受到限制。”
考虑到类器官的不规则形状和保持无菌的挑战，人工测量是很困难的。处理程序可以帮助研究人员在不破坏银行的情况下进行精确的显微镜测量。
“只要你有一个基本的显微镜相机，你就可以拍摄你的类器官培养的图像，并用ImageJ等免费软件处理它们，”谢尔曼说。
但她指出，这类服务并不适合大量工作。
“如果你想做高通量的研究，”她说，“你可能需要投资更昂贵的设备。”
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