以下文章最初发表于2017年10月30日的《细胞培养皿》在这里．
在过去的十年中，类器官培养已经迅速成为创造“迷你器官”的流行方法，以支持器官发生研究、疾病建模以及随后新疗法的发展。科学家们正在实验室培育微型器官，迄今为止，这些器官包括肾脏、肝脏、大脑、前列腺和胰腺，它们的组成和功能更接近器官。
有许多方案、工具和技术可用于类器官培养——从微板、细胞外基质、水凝胶、生物打印到微流体。根据你的细胞类型、研究领域和最终目标，选择似乎是压倒性的。
那么如何知道从哪里开始呢?从已经完成的工作中学习是一个很好的开始。我们已经组建了康宁生命科学专家团队，他们随时准备回答您与有机生物相关的问题。康宁在3D细胞培养方面拥有超过30年的经验，并提供了一些原始的和最广泛使用的3D工具，例如康宁®基底膜基质®矩阵，Transwell®渗透支持和康宁球形微孔板．
康宁专家包括高级发展科学家Li Feng、应用科学家Hilary Sherman、高级发展科学家Himabindu Nandivada和高级科学支持专家Nitin Kulkarni。Li Feng博士一直致力于肝脏毒性和疾病建模的三维肝脏模型系统。他最近的工作包括建立肝脏3D球形培养程序，测试原代人肝细胞(PHH)进行3D球形培养，以及在康宁超低附着球形微板中进行慢性肝毒性测试和PHH球形重复给药的试验开发。Hilary Sherman是康宁生命科学公司的应用科学家。她曾与各种各样的细胞类型合作，包括哺乳动物、昆虫、原代细胞和干细胞，在大量的应用中，包括3D培养。Nandivada博士在人类多能干细胞培养和材料科学方面有超过10年的经验。Kulkarni博士在科学支持小组工作了几年，支持3D细胞培养，最近发表了关于用于类器官培养的表面的演讲和网络研讨会。
球体培养和类器官培养在表面要求上有什么不同?
椭球体可以是一个或多个细胞类型的聚合体，其中细胞不附着在一个表面上，而是附着在其他细胞上形成椭球体。超低附着椭球微板是在同一微板中形成和测定椭球体的理想工具。另一方面，类器官，分化和自组织，形成类似的3D结构，至少部分功能类似于它们相似的器官。它们需要附着在细胞外基质上，如康宁基质或胶原蛋白i，以及特定的发育信号来组织成类器官。
有没有适合生长类器官的无动物/合成表面?
康宁基质是最成功的动物细胞外基质之一，已被用于培养类器官。有多份关于设计合成基质来生长类器官的报告，这些研究与它们在基质基质中的形态/功能进行了比较。研究人员已经成功地为特定的类器官或应用生成了它们，并且还有很多正在进行的工作。示例可以在下面的参考文献中找到。
是否有一种有效的方法使类器官与高通量药物筛选环境兼容?
用类器官进行高通量筛选是一项新兴技术，科学家们正在寻找有效的方法来解决这一问题。康宁基质是类器官工作流的首选基质，适合于各种类型的类器官的生长。有两种常用的方法来分发HTS格式的类器官;一种“三明治法”，其中基质被分配到选择的板格式，并允许聚合。接下来，类器官细胞悬浮液与稀释的基质混合，并分配在聚合层的顶部，并允许孵育额外的时间(Cell 2015 161,933 - 945)．另一种方法是将类器官细胞与Matrigel基质混合，并使用机器人平台将其分配成感兴趣的hts格式，同时将培养皿保存在凉爽的架子上(生物分子筛选杂志2016年第21卷(9)931-941)．然后将它们预培养几天，然后用药物化合物进行挑战。我们还成功地利用康宁96孔球微板来区分iPSC球，然后用康宁矩阵矩阵进行覆盖。这种方法允许在每个孔中形成一个单一的类器官。成像兼容板格式是理想的，如果终点是显微镜;康宁提供多种与成像兼容的平板格式，包括圆形底、平底底或球形底。通常，研究人员还使用生存力分析来评估这些3D培养中的药物毒性。
我想听听您对类器官免疫染色的最佳实践建议。
类器官既可以从水凝胶/细胞外基质中回收，也可以在基质中染色，这取决于所使用的基质和浓度。为了从康宁基质中回收类器官，培养物可以用康宁细胞恢复液(而不是disase，因为它会使单细胞悬浮，除非这是所期望的结果)处理，以释放类器官，然后继续固定，渗透和染色类器官。另一种选择是直接在基质中染色类器官。这种方法可以提供更高的背景，因此需要优化阻塞/清洗以获得最佳信噪比。推荐使用无酚红基质，以减少免疫染色时的背景。通常，渗透和染色浓度需要更高，培养步骤将更长，以便穿透整个类器官。如果在加工前嵌入类器官，康宁有一个可用的协议，指导您完成球形加工和组织指南的嵌入(cls -一- 431)．Visikol是一种清除剂，可以更好地显示已被免疫标记的3D结构。抗原提取的要求和随后的染色方案的嵌入组织将必须优化的目标抗原。请参阅以下参考资料:
Lee, Genee Y.，等。"正常和恶性乳腺上皮细胞的三维培养模型"自然方法4.4(2007):359-365。
我觉得类器官培养最大的挑战之一是输送营养和气体交换，尤其是在类器官生长的时候。想法或建议?
类器官需要持续的新鲜营养和废物清除，因为培养物的大小不断扩大，因为它们没有血管化，正如你的问题所建议的。为此目的，有3个建议:
研究人员已经成功地培养和维持嵌入在康宁基质液滴中的类器官，然后悬浮在康宁纺丝瓶的介质中。兰开斯特和诺布利奇在长达15个月的时间里保持了4毫米大小的脑类器官。请参考这里的协议纸．
我们通过频繁(每周2至3次)更换2毫米类器官的培养基，成功培养了肠道类器官，并维持了长达6周。McCracken等人用这种方法将这些类器官传代了140天协议．
灌注是一种可以持续补充营养物质和清除废物的选择，越来越多地用于器官芯片培养，以保持所有营养物质、生长因子、代谢产物在一个恒定的平衡，一旦优化，培养可以比静态培养保持更长的时间。
类器官培养的时间表是什么时候?我应该期待什么时候开始看到形成的开始，传代的时机，介质的变化?
类器官的发育进程和类器官培养中不同步骤的时间取决于细胞的来源、使用的方案(例如培养基配方)和所需的类器官类型。在一些方案中，类器官培养过程开始24小时后就可以观察到类器官结构或芽。例如，在从人多能干细胞生成大脑类器官的过程中，在将EBs播种到Matrigel基质后的1-3天内，可以看到神经上皮芽(兰卡斯特和诺布利奇，Nat Protoc, 2014年)．长期的分化/成熟过程可能持续几周或几个月。
以下是一些关于这个主题的评论文章:
你对与类器官最有效的培养容器有什么建议?这对成像也很有效。
用于类器官培养的培养容器类型取决于用于类器官的方案。在类器官的生成、培养和表征的不同阶段使用不同的培养容器。组织培养处理过的血管(多孔板或盘子)可与天然(康宁基质、胶原蛋白、层粘连蛋白/隐动蛋白)或合成水凝胶一起使用，在静态培养中启动类器官的形成和培养。长期的类器官培养也在搅拌培养系统中进行，如轨道搅拌器或旋转烧瓶(兰卡斯特和诺布利奇，Nat Protoc, 2014年)．康宁球形微板也可用于生成和培养类器官。类器官也在培养基滴液中培养，或悬挂在由重力和表面张力维持的平板上，或悬挂在康宁低附着板上。（Hohwieler M，等。Gut, 2017, Shamir和Ewald, Nat Rev Mol细胞生物学，2014)．
在成像方面，康宁提供了许多96孔和384孔格式的微孔板，这些微孔板与高通量成像技术兼容。
我在康宁基质中从iPSC细胞中培养肠类器官。我计划从基质中收集类器官用于后续测试和分析。你能推荐一个收获的方案吗?
我们建议康宁电池回收液，100mL(产品号354253)用于从康宁基质中收获类器官。下面是一个一般指南，以96孔球体微板中6周大的类器官为例。培养时间可优化以获得最佳效果。
- 用150µL冷PBS冲洗井两次(类器官可通过重力或离心沉降)
- 每孔96孔球形微孔板加入150 μ l冷康宁细胞恢复液
- 4°C孵育1小时
- 用150µL冷PBS清洗类器官1x
- 在新鲜介质或所需缓冲液中重新悬浮类器官，以便后续分析
您如何看待类器官与内皮细胞共培养的研究?你发现良好的培养基能使类器官获得足够的营养吗?
在这一点上，体内类器官没有自己的血管系统，但内皮细胞已被证明在一些类器官中形成基本的血管结构，如肝芽。当它们被植入免疫缺陷小鼠体内时，宿主血管系统与这些结构融合，形成功能血管网络，最终在这些小鼠体内形成功能肝芽。请参考此期刊文章欲知详情。有大量的研究将内皮细胞和间充质干细胞与诱导多能干细胞混合，或将血管系统生物打印成3D结构。在其他情况下，共培养球体中包括内皮细胞以增强功能，例如本文所述的肝细胞球体文章．
关于第二个问题，一旦培养基被优化为类器官培养，充分的营养和废物清除是通过使用旋转烧瓶，灌注或频繁更换培养基来实现的。类器官需要持续的新鲜营养和废物清除，因为培养物的大小扩大，因为它们没有血管化。为此目的，有3个建议:
- 研究人员已经成功地培养和维持嵌入在康宁基质液滴中的类器官，然后悬浮在康宁纺丝瓶的介质中。兰开斯特和诺布利奇在长达15个月的时间里保持了4毫米大小的脑类器官。请参考这里的协议纸．
- 我们通过频繁(每周2至3次)更换2毫米类器官的培养基，成功培养了肠道类器官，并维持了长达6周。McCracken等人用这种方法将这些类器官传代了140天协议．
- 灌注是一种可以持续补充营养物质和清除废物的选择，越来越多地用于器官芯片培养，以保持所有营养物质、生长因子、代谢产物在一个恒定的平衡，一旦优化，培养可以比静态培养保持更长的时间。
类器官的大小和致密性确实在营养和氧气分配中起着作用。在类器官内依靠被动扩散来提供营养物质或氧气是有局限性的。因此，在一个球形团块内的细胞的代谢状态可能是非常不同的。以肿瘤样研究为例，坏死和缺氧反应的迹象发生在那些较大的球体内。因此，类器官类型、培养基等培养条件都需要考虑营养和供氧的因素。
球体和类器官的区别是什么?它们的用途是什么?
球体和类器官都是由许多细胞组成的三维结构。虽然这个术语可以互换使用，但它们之间有明显的区别。类器官是“从干细胞或器官祖细胞发展而来的器官特异性细胞类型的集合，并以类似于体内的方式通过细胞分选和空间受限的谱系承诺自我组织”(Science 2014)。345:124)。另一方面，多细胞肿瘤球形模型在70年代初首次被描述，并通过在非粘附条件下培养癌细胞株获得(J. Natl。癌症研究所，1971年。46:113)。肿瘤球，是癌症干细胞扩张的模型;组织来源的肿瘤球体和有机型多细胞球体通常是通过肿瘤组织机械分离和切割获得的(Neoplasia(2015) 17,1 - 15)。一般来说，与球形培养相比，类器官有更高阶的自组装，前者更依赖于基质来生成。
类器官作为一种模型最近引起了极大的兴趣，主要是与2D甚至3D共培养系统相比，它可以作为一种更好的体外模型。类器官研究的共同兴趣领域包括器官发育、药物筛选、疾病建模和毒性测试。希望类器官能让研究人员离体外模型更近一步。以下是一些讨论最近类器官出版物的评论:
Ranga, Adrian, Nikolche Gjorevski和Matthias P. Lutolf。“通过基于干细胞的类器官模型发现药物。”高级给药评论69(2014):19-28。
尹小雷，等。“工程干细胞类器官。”细胞干细胞18.1(2016):25-38。
类器官培养有什么特殊的培养基要求吗?或者仅仅满足这种细胞类型的特定需求就足够了吗?
正如佐藤和克利夫斯最近的评论所描述的那样，这取决于感兴趣的类器官。研究人员一直在开发和优化他们最喜欢的肾脏类器官培养基(夏云等(2014).自然学报，9:2693） （弗里德曼B.等人。Nat Commun. 2015;6: 8715)，大脑(Lancaster M.A.和J. A. Knoblich (2014) Nat. Protocols. 9:2329)或肺类器官(Dye B.R. et al.(2015)。4: e05098） （Nikolick and Rawlins, 2017年Curr Pathobiol代表;5 (2): 223 - 231)．通常，一个好的起点是用于二维单层分化的介质，经过修改和优化。
是否有证据表明成功地将类器官作为微型器官用于药物测试?我知道这个想法是存在的，但是有人成功地使用这个吗?
人们对在药物筛选中使用类器官的兴趣越来越大，制药行业现在也在寻求使用该平台。然而，要使这项技术成为药物筛选的常规技术，仍有许多挑战需要克服。在囊性纤维化跨膜电导调节(CFTR)基因突变的囊性纤维化患者亚群中记录了首次成功。Vries团队从CFTR突变患者的直肠上皮中创建了类器官，并测量了两种药物(由Vertex制药公司生产的ivacaftor和lumacaftor)对类器官肿胀的反应。他们发现2名携带罕见CFTR突变的患者的类器官对药物有反应。基于体外试验的成功，这些药物被给予反应良好的患者。这是第一次成功地将类器官反应中的事件与患者的生理反应相关(科学Transl。地中海》2016。第八卷，第344期:344ra84;Nature Rev. Drug discovery . 2017。16: 6 - 7)．
有关更多信息，请参见瀑样模型．
