以下文章最初发表于2019年11月11日的《细胞培养皿》杂志这里．
类器官的培养使研究人员能够使用一个高度生理相关的系统来研究人类疾病。人体类器官反映了肾、肺、肠、脑和视网膜等器官的关键结构和功能特性，使它们具有极高的价值，特别是在对体外人体模型需求未得到满足的情况下。
虽然它们的价值是不可否认的，但培养类器官可能是相当具有挑战性的。目前已开发出许多用于类器官培养的工具和技术，但根据细胞类型、研究领域和实验目标的不同，很难确定正确的方法。
在这次专家问答环节中，我们已经召集了一个专家团队来回答您关于使用类器官进行疾病建模的问题。请参阅下面专家的简历。
杰Wang博士
康宁生命科学公司发展助理
王杰，康宁生命科学发展副研究员。在她在马萨诸塞州贝德福德的康宁发现实验室工作的10年期间，她领导了多种重组蛋白和细胞基础产品的开发。她在波士顿学院获得博士学位，在哈佛医学院获得博士后培训。
伊丽莎白·亚伯拉罕博士
康宁生命科学高级产品经理
自2008年以来，Elizabeth一直受雇于Corning Life Sciences (CLS)，并担任多个高级职务，包括研发、项目管理和业务运营。在CLS，她领导各种新产品的开发，包括先进的细胞外基质/表面涂层和哺乳动物原代和干细胞培养的实验室设备。她撰写了23篇期刊文章和技术笔记，是11项专利的发明者。在她的早期职业生涯中，她在细胞疗法评估潜在的干细胞治疗糖尿病。目前，她是器官和3D细胞培养产品的业务主管;将客户的意见转化为新的概念，并在全球范围内实现商业化。
弗兰齐斯卡Wienholz博士
科学支持专家EMEA
弗兰齐斯卡Wienholz已经进行了DNA损伤修复她的博士研究，她能洞察其分子调控，有助于理解细胞如何应对DNA损伤，防止过早衰老和癌症。自从2017年她正在为科学支持专家康宁，她参与了内部和外部的客户提供产品支持，在设计建议，并设置实验了，并通过面向客户的活动，如研讨会和展示提供科学数据网络研讨会。
Sylvia F Boj博士
Hubrecht Organoid Technology科学总监
Sylvia F Boj于2006年在西班牙巴塞罗那大学获得博士学位，她在IDIBAPS的工作是破译胰腺细胞中MODY基因转录作用的功能遗传分析。
她获得了EMBO的长期奖学金，随后加入了Hubrecht Institute (Utrecht, Netherlands)作为博士后研究员。在汉斯·克利夫斯教授的实验室里，她首先研究了TCF7L2调节新陈代谢。然后，她建立了一个在体外人类胰腺癌的类器官模型。2014年，她加入Hubrecht Organoid Technology(乌得勒支，荷兰)，担任囊性纤维化和癌症项目的小组负责人。2016年,她被任命为科学中心主任,把科学进步的终极目标的瀑样技术新药的发展,通过与制药公司交流,和发展临床试验验证的预测价值瀑样反应的患者。
我们想对我们的类器官进行长期测试，但我们无法让它们超过24小时。你对推广我们的文化有什么建议吗?
生成类器官是一个微妙的过程，需要对所使用的特定细胞和应用进行调整和测试。类器官培养也是一个同样敏感的过程，需要对细胞和类器官的具体要求进行评估。
有机物的成功生成和长期培养取决于许多因素，包括:
- 细胞类型（干细胞？从哪个器官？）
- 培养条件(培养条件，培养基，使用的ecm ?)
- 细胞挑战(低生存能力，可分解的器官，等等)
- 什么分析方法是组织体产生后的计划？
由于在这个问题中没有列出这些信息，我们想分享一些关于有机物的生成和培养超过24小时的有用技术文件:
报名须知：
你知道有什么地方有基于细胞类型创造不同类型器官的协议吗?
近年来,康宁®基底膜基质®矩阵在基础研究和药物发现等领域，已经发展成为一个强有力的类器官培养的新工具，有几个可用的协议来支持这项工作。请在下面找到一些技术文件建议，支持创建不同类型的有机物。
康宁基质基质和类器官培养的引文
研究文章引用的汇编，其中几个类器官被引用。
用类器官建模发育和疾病
在这篇综述文章中，Hans Clevers概述了几种器官类型以及它们是如何生成的。使用这些基本信息作为起点，我们建议对特定的器官类型进行特定的文献搜索，以找到最适合所需应用程序的协议。
器官模型和应用
访问康宁生命科学类有机物模型和应用网页，了解更多关于各种类有机物类型的信息，并访问有关讨论生成类有机物方法的已发表的里程碑论文。
更具体的器官资源:
胃肠道瀑样
单个Lgr5干细胞在体外构建隐窝绒毛结构而没有间质生态位
前列腺有机体
人前列腺类器官培养中多能管腔祖细胞的鉴定
指导人类胚胎干细胞分化走向天堂肾生成自肾脏组织
卵巢瀑样
长期的类器官培养显示，在小鼠输卵管的伞状部分有丰富的类器官形成的上皮细胞
肝脏和胰腺类器官
自我更新的人和小鼠肝脏和胰腺三维器官的培养、建立及其遗传操作
我们正在寻找一种合成替代康宁基质培养我们的肠道细胞类器官。你能推荐一个吗?
近年来，人们对评价基质基质替代培养类器官的方法越来越感兴趣。研究人员已经证明，海藻酸盐和功能化聚乙二醇(PEG)配方可以支持人类多能干细胞衍生的肠道类器官以及健康小鼠肠道组织的器官祖细胞。然而，研究人员需要适当调整合成水凝胶的刚度和功能化。控制生物化学线索和结构支持对获得成功的器官生长是很重要的。这里有一些关于这些方法的链接。
在这方面，还应该注意重要的是，许多这些合成选项可能不一样强大，它能够支持化培养能力基质胶。对于如合成的制剂可以支持从健康肠组织但不患者来源的类器官类器官的生长;它们可能不支持与类器官生长（出芽对囊性形式）相关联的各种形态。在多能干细胞（PSC）衍生的类器官的那些情况下，一个扩展仍然之前移动到合成的环境中的基质胶的PSC矩阵;因此总共合成替代基质胶基质是尚未被识别。
康宁最近推出了新的基质胶基质化培养，优化的ECM提供生化线索，孔隙度和刚度，以文化肠类器官。
我对可伸缩性很好奇。要使其对药物发现起作用，必须有相当高的产量。我很想听听您关于如何提高吞吐量的想法。
类器官的性质为药物的发现提供了良好的基础。正如问题中提到的，将有机物转移到高通量筛选环境中需要大量的有机物。尽管目前在这一领域仍然存在挑战，包括劳动密集型工作和时间，但有一些协议简要介绍了如何扩展类器官。
应用注意事项及检讨文章:
为了可扩展性，有机化合物可以镀在单孔板上。当为药物筛选准备类器官时，一个额外的分割，其中类器官按1:1处理并再次镀1-2天，可以显著增加类器官的数量。这给了类器官从破坏的压力中恢复的时间，让它们达到筛选活性的适当大小(20-70µm)。我们没有很好的经验把药物筛选的器官镀成单细胞，因为不是所有的单细胞都能以类器官的形式生长。在药物筛选的类器官操作过程中，我们建议在洗涤介质中添加RhoKi 10µm，以减少未被ECM包围的类器官所产生的压力。我们不建议在收集所有材料时将有机物储存在冰上。
Higher throughput for drug screening can be achieved by studying organoid in HTS microplates (e.g. 384-well plates) coated with Corning Matrigel matrix, using the “sandwich” method or embedded method (refer to Corning CLS Guideline for use SPC-356255-G). You can also refer to the article, “三维结肠癌患者源性器官培养高通量筛选平台的建立和验证，报告了384孔格式的结肠癌患者3D类器官培养高通量筛选平台的建立和验证。
我们还没有看到后3天内的任何类器官的形成与我们的肝细胞，我们应该给它更多的时间或重新开始吗？
通常情况下，3天，很短的时间，但它也将肝细胞接种为单个细胞或细胞团块分离后，取决于你的原始材料（小鼠或人类肝细胞）的性质和是否。在单人肝细胞的情况下，它需要一个多星期开始观察肝类器官。
在传统的2D单层培养条件下，原代人肝细胞(PHHs)迅速丧失肝脏表型，而3D培养的PHHs可维持数周的活力和功能。
为了支持3D肝球体模型在药物发现和开发研究，康宁提供三维球形合格的原代人肝细胞使用康宁球体微型板块．使用应用说明中描述的协议:3D原代人肝细胞(PHH)球体与2D PHH单层培养相比，显示对药物诱导的肝损伤的敏感性增加， PHHs形成小细胞团簇，大细胞聚集，然后在6 - 7天内形成球形。PHH球体一旦形成，形态和尺寸测量表明，球体在4周内保持稳定。
根据这一发现，球体的生成可能需要7天。
然而，这些球体是由原代人肝细胞产生的。例如，类器官可以从孤立的导管细胞中产生。在“自我更新的人类和小鼠成年肝脏和胰腺3D器官的培养和建立及其遗传操作”中，描述了一个生成器官的协议，其中分离的导管细胞被培养在康宁人工基底膜基质在培养约7天后，可以看到类器官。
对于这两种方法，球体/器官的形成可能需要7天。因此，我们建议继续培养细胞，并在第7天重新评估类器官的存在。
我们正在使用的Hans聪明的纸媒体发展基于肝类器官。你多久建议媒体的变化？我们看到，我们的一些组织体都经过媒体的变化右死亡，每2-3天。
为了支持器官生长，我们建议每2-3天更新一次培养基。有些化合物在37°C的温度下几天后就不太稳定了。观察到，在介质恢复后，类器官立即死亡，这表明需要对介质配方进行修订或优化。你也可能需要优化试剂的最终浓度，因为如果这些配方都是正确的，类器官的死亡是不可预料的。
你有把癌细胞球体变成类器官的方案吗?
尽管从癌细胞中生成类器官似乎是矛盾的，但研究人员现在正专注于这种方法来研究癌症中发现的异质性以及个体化医疗的发展。癌类器官可以概括器官功能并表达器官特异性标志物，如下文所示:病人来源的肺癌器官作为治疗筛选的体外癌症模型。
有几篇文章是可用的，其中描述了从癌症患者的活组织检查产生的器官。例如:癌症样本生物银行在下一层次：结合组织与活细胞库，以促进精密医学。
可能由于球体的性质，关于从球体产生类器官的资料比较有限。然而，在下面的文章中已经描述了“肠道”球体可以形成类器官，提高有机物成品率的工艺工程方法。
我正在做一个多步骤的长期实验，我需要冷冻保存我的器官，然后在一个月后解冻它们。我在努力寻找做这件事的最佳方法。
类器官的低温保存对于改进基于类器官的治疗和获取大量细胞变得越来越重要。请在这里找到一篇文章，其中描述了非解离或解离的肠道类器官的低温保存:长期培养诱导的Rho通过的处理定时的小肠类器官的表型差异，高效的冷冻保存激酶抑制剂。
有趣的是，当使用老鼠或人类的类器官时，冻结的协议可能不同。这是礼仪手册描述化培养包括那些为人类和小鼠的组织体冷冻保存。
此外，我们已经观察到，在器官解冻后，细胞存活率显著增加，经过处理后，如在Tuveson实验室协议，步骤1的大小（30-40之间μm）的小，类器官在55％的细胞外基质（ECM）镀下降1-2天。有了这个电镀工序，我们让类器官从中断的压力中恢复，但在冷冻前也激活增殖状态权利。经过1-3天（取决于人类器官模型，例如1天后一些组织体的尺寸在视觉上增加（结肠癌），而其他需要三个工作日（肺癌或乳腺癌）。我们从ECM下降收集它们并冻结他们下面的步骤在步骤3起表示。我们已经观察到一些ECM的粒料中存在没有在组织体的生存产生负面影响，所以额外的洗涤，以去除ECM是不需要的。我们建议吸取ECM免费从粒料类器官。
我对薯片文化不是很熟悉。这种工作与普通文化相比如何?
当使用更复杂的器官模型时，有许多重要的因素需要考虑，包括细胞外基质、流体运输、受控介质交换和空间分离。对于这些更先进的模型，结合使用细胞外基质和“芯片上的器官”方法可能是有用的。这种芯片就像一个“支架”，可以用来制造隔间。
请在这里找到一些在芯片上培养的器官:
- 肠道芯片微环境诱导人肠道细胞进行绒毛分化
肠类器官：芯片的使用允许的文化有一个顶端和基底面，使细胞表现出增加肠道细胞的标记。 - 在三维培养模型中，间质流动调节内皮细胞的血管生成反应和表型
血管形成:迄今为止，血管的形成仅在3D细胞培养中被成功证实。结合芯片，可以模拟间隙流体流动、剪切应力和生长因子梯度。
与2D培养相比，培养器官的成本如何?时间和实验室资源呢?
这个问题特别难以回答，因为没有格式、体积和协议具有可比性的“标准”2D或3D细胞培养协议。一般来说，用于2D细胞培养的产品不如用于3D细胞培养的产品先进，因此，3D细胞培养的直接成本通常高于传统单层细胞培养的实验成本。此外，在几天内，一个简单的单层细胞可以形成;3D细胞结构如类器官的生成可能需要几天时间，但在此期间，细胞培养人员不需要进行详细的步骤。
然而，在某些应用中，传统的2D实验无法得出与3D细胞培养实验相同的丰富答案，因为在3D环境下生长的细胞更接近于组织和器官的体内行为。3D细胞培养环境为药物发现创造了更多的生物学相关模型，这可能导致更多的预测结果，更高的药物化合物测试成功率，更快的市场路径，并降低开发成本。如果您对在您的实验室中建立3D细胞培养和生成有机物感兴趣，可以使用产品和解决方案，使开始3D细胞培养变得容易，例如。康宁球体盘子或康宁基质胶基质类器官培养。
关于3D细胞培养的其他资源:
瀑样模型
球体模型
组织模型
有机体培养依赖于基质/支架，通常康宁基质素基质，其本身可以提供许多有助于有机体生长/分化的生长因子等。是否有替代，较少的生物活性基质，可以支持有机培养物？
在Hubrecht Organoid Technology，康宁人工基底膜基质是迄今为止支持类器官模型扩展的最好的细胞外基质(ECM)。为了减少生长因子或其他蛋白质/分子的存在所产生的可变性，我们总是与之合作经济增长的因素都可以降低和无酚红矩阵的版本。我们一直在寻找生物细胞外基质的合成替代品，但迄今为止，我们测试过的任何东西都无法支持类有机物的生长，达到基质基质的可比水平。
为了支持类器官研究重复性和一致性至关重要，康宁最近推出的基质胶用于化培养。这种优化的制剂被证实支持生长和organoids1的分化与基质硬度测量每批，属性支持类器官的工作流程。基底膜基质化培养已被证实来自健康和患病细胞的起源成功地培育出类器官2．每个批次都有资格形成常用于有机培养物中的稳定的“3D圆顶”结构。
你能解释一下什么时候你想用无血清的培养基进行类器官培养，或者什么时候可以用含血清的培养基。
当在规定条件下扩大类器官时，我们建议避免使用血清。在Hans Clevers实验室开发的所有培养基配方中，当组织特异性器官模型需要Wnt3a存在时(即人类肠道模型)，血清的存在被发现。Wnt3a条件培养基中含有5%的胎牛系统(FBS)，这是产生活性Wnt3a最有效的方法。幸运的是，无血清Wnt3a的替代来源正在变得可用，如替代Wnt (Garcia实验室，斯坦福)，使在没有血清的情况下扩大类器官成为可能。
扩散动力学和器官健康和大小-有什么培养策略来改善这一点，以允许培养更大的器官?在同样的静脉-策略支持长期培养类器官，模拟血管化?
扩散动力学可以调节类器官的大小和健康:当达到一定的大小时，类器官就会停止生长并形成坏死的核心。这个过程可能与从增殖的茎样状态转变为非增殖的分化状态以及类器官核心的坏死有关。晚期分化是限制器官大小的一种策略，但防止坏死核心对器官健康至关重要，因为它可能导致过早分化。营养物质在类器官周围的灌注/流动是一种技术，已在科学文献中讨论，以协助预防坏死核心。类器官血管形成是长期培养的重要标准;在系统中播种内皮细胞以形成血管(新血管生成)，以及使用生物打印技术来设计细胞的结构和放置，都是朝着这一目标探索的重要平台。
